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本制品采用两步法提取线粒体DNA，先纯化线粒体，再柱式法纯化其中的DNA，基因组DNA污染少。适用于各种动物悬浮培养细胞和贴壁培养细胞，不建议用于动物实体组织。

线粒体是非常重要的细胞器，它不但跟很多人类疾病相关，而且还是母系遗传研究的重要材料。对线粒体进行遗传研究和进化研究都需要纯化线粒体DNA。

• 即开即用，用户不需要自己配制各种溶液，优化各种条件。
  
• 提供线粒体染液，可以在操作中随时监测纯化过程中线粒体的完整性。

本制品可以用于15次动物线粒体DNA纯化，一次可以处理约1×10⁸个培养细胞（相当于5瓶150mm培养细胞），可以纯化到到0.2～0.5mg线粒体。

• PBS缓冲液、氯仿、0.5M EDTA溶液（pH8.0）。
  
• 人细胞核专一性TPMTVNTR
  上游引物5 GCT CCG CCC TGC CCA TTT 3，
  下游引物5 GCC TCC GCC ACC AAT GAC 3，
  
• 人线粒体专一性HV2区
  上游引物5 GGT CTA TCA CCC TAT TAA CCA C3，
  下游引物5 CTG TTA AAA GTG CAT ACC GCC A3。

• 线粒体膜对温度高度敏感，故必须在冰上或冷室操作，溶液和离心管都需预冷。
  
• 本制品只能用于科研。

• 将50mL动物线粒体提取溶液A和250mL动物线粒体提取溶液B放冰上预冷待用。
  
• 配制1.0M低比重溶液100mL：将34克蔗糖用100mL动物线粒体提取溶液B溶解并放冰上待用。
  
• 配制线粒体重悬液100mL：将75mL动物线粒体提取溶液B和25mL 1.0M低比重溶液混合，放冰上待用。
  
• 未用完的1.0M低比重溶液和线粒体重悬液需要-20℃保存，否则容易长菌。下次使用前需充分溶解沉淀并摇匀。

• 线粒体粗提
  
  • 如果提取材料是单层培养细胞，先用20mL自备的PBS缓冲液洗涤1×10⁸个培养的单层细胞，共洗涤2次。然后用塑料刮匙刮下细胞，重悬在20mL PBS缓冲液中。如果是悬浮细胞，则4℃1000g离心10分钟收集1×10⁸个细胞，再用20mL PBS缓冲液洗涤2次，最后将细胞重悬在20mL PBS缓冲液中。
    
  • 用平甩转子（swinging-bucket rotor）离心机1000g 4℃离心10分钟，弃上清留沉淀。
    
  • 加入5倍体积(以细胞沉淀的体积为基数)的预冷的动物线粒体提取溶液A，轻柔重悬细胞。
    
  • 冰上放置4～5分钟。
    
    • 冰浴时间不要超过5分钟。
  • 如果是成纤维细胞，由于其难以裂解，可将细胞重悬液在-80℃放置20～30分钟后再化冻，然后进入下步操作。如果不是成纤维细胞，则直接进入下步操作。
    
  • 将细胞重悬液体转移到预冷的Dounce玻璃匀浆器中（工作体积为10～15mL，间隙为0.12mm，最好是玻璃材质，否则线粒体产率会降低）匀浆适当次数。
    
    • 细胞株不同，其最适匀浆次数不同，一般需要40次～60次左右。
      
    • 匀浆是线粒体纯化最关键的步骤，故匀浆前最好先通过预实验确定最适匀浆次数，方法是每匀浆5～10次后，取2～3μL匀浆液到载玻片上，然后在相差显微镜下观察，完整细胞数量降低到20%以下为佳。
  • 加入1/3体积的、预冷的1.0M低比重溶液，轻柔混匀。
    
  • 用平甩转子离心机4℃1000g离心10分钟。沉淀含残留完整细胞、细胞碎片和细胞核，上清液含线粒体。
    
  • 转移上清液到离心管中，冰上放置。在显微镜下检测上清液中线粒体的完整性。具体做法是先滴50μL左右上清液到载玻片上，再滴入50μL詹纳斯染液绿B染色液20分钟，油镜下观察，蓝绿色颗粒状物即为线粒体。
    
  • 用固定角度转子（fixed-angle rotor）离心机4℃ 15000g离心15分钟，弃上清，所得棕黑色沉淀即为粗提线粒体沉淀。
    
  • 用5mL线粒体重悬液重悬线粒体，4℃15000g离心15分钟，弃上清。
    
  • 重复上步一次。
    
  • 如果后续实验是提取mtDNA用于PCR或Southern杂交，则直接进入第四部分mtDNA提取，也可以放-80℃长期保存待用。如果后续实验是提取mtDNA用于高通量测序，则必须彻底降解掉其中的细胞核DNA污染。匀浆过程中一个破裂的细胞核释放出的DNA相当于上百万个线粒体的DNA量之合，所以无论如何小心，粗提线粒体中必有大量的细胞核DNA污染，如果不将其清除，高通量测得的序列将绝大部分来于核DNA而非mtDNA。
• 细胞核DNA的去除及鉴定
  
  • 将线粒体重悬于0.3mL预冷的线粒体重悬液中，取10μL作为未处理线粒体（后面将使用）。
    
  • 加入6μL Benzonase（1U/μL）溶液和30μL DNase A溶液。
    
    • 配法：将0.5mL 10×DNase A反应液加到装有5mg DNase A干粉的离心管中得到10mg/mLDNase A溶液，未用完的此溶液需要分装后放-20℃保存。
  • 37℃保温一段时间酶切细胞核DNA。注意：最好先预实验，每隔一段时间取10μL样品，灭活其中的DNase后作为模板用PCR扩增人基因组TPMT VNTR位点和人mtDNA HV2区(两基因的PCR引物见自备试剂)，检测不到VNTR基因而能检测到mtDNA基因的处理时间为最佳。相关引物和PCR试剂需要自备。可用未处理线粒体作为对照。
    
  • 加入10μL自备的0.5M EDTA溶液（pH8.0）以终止酶反应。詹纳斯绿B染色并在显微镜下检查线粒体完整性（操作见上）。
    
  • 4℃10000g离心10分钟，弃上清。
    
  • 用1mL的预冷线粒体重悬液重悬线粒体后，4℃10000g离心10分钟，弃上清留沉淀。
    
  • 重复上步操作，最后得到无基因组DNA污染的线粒体沉淀。
• 线粒体DNA提取
  
  • 在线粒体沉淀中加入600μL预热的细胞器DNA纯化溶液A到线粒体沉淀中，充分吹打均匀。
    
  • 再加入300μL预热的细胞器DNA纯化溶液B到离心管中（此溶液粘稠，需要预热到65℃取用），颠倒数次混匀。
    
    • 此时溶液中可能有白色丝状悬浮物产生。
  • 65℃放置5分钟。
    
  • 加入200μL自备氯仿，震荡混匀10～30秒，此时溶液将呈乳白色。
    
    • 如果省略次步，得到的DNA中将有蛋白污染。
  • 12000g室温离心2分钟。此时上清液将变得透明，中间层有白膜。小心转移上清液到一个新的1.5mL塑料离心管中，避免触及中间的白膜。
    
  • 加入1.5倍体积的细胞器DNA纯化溶液C，颠倒混匀后转移到离心吸附柱中，静置2分钟。
    
  • 12000g室温离心1分钟，弃收集管中的穿透液。
    
  • 将0.5mL通用洗柱液加入离心柱中，12000g室温离心1分钟，弃穿透液。
    
  • 重复上步操作一次。
    
  • 空甩半分钟去除残留液体，将离心吸附柱转移到新的1.5mL离心管中。
    
  • 加30～50μL DNA洗脱液（基因组DNA专用），室温放置3～5分钟。
    
  • 12000g室温离心1分钟即得纯化的mtDNA溶液，立即使用或放-20℃长期保存。